محتوى ال DNA وأهميته كواسم إنذاري في المرضى المصابين بطلاوة فموية DNA Content as a Prognostic Marker In Patients With Oral Leukoplakia
تعد الطلاوة الفموية ذات قدرة كامنة على أن تستحيل إلى كارسينوما شائكة الخلايا. وإذا حدث ذلك فإن احتمال البقاء أكثر من خمس سنوات ضعيف لذا فإن الإنذار الدقيق هام عند المرضى المصابين بطلاوة فموية لأن تجنب التدخين والكحول والعلاج الملائم يمكن أن يجنب نشوء السرطان تصنف 15 – 5 % من الطلاوة الفمويةعلى أنها عسر تصنع بشروي Dysplasia ويتطور 20 -15 % منها إلى كارسينوما، وبما أن التصنيف النسيجي لآفات عسر التصنع قليل الأهمية في الإنذار لذا فإن العلاج لا يُجرى إلا إذا وجد دليل نسيجي على الاستحالة لكارسينوما داخل البشرة أو لكارسينوما غازية، وقد كشفت واسمات جزيئية لكن هناك نقص بالعوامل ذات القيمة الإنذارية في الآفات قبل السرطانية.
وقد بُرهن نسيجياً أن الشذوذات في عدد الصبغيات هي سبب أكثر من كونها نتيجة للإستحالة الخبيثة والأكثر من ذلك فإن الطفرات المورثية التي تحدث عند افتراق الصبغيات خلال الانقسام والشذوذات في الجسيم المركزي وصفية لحالة عدم الاستقرار الصبغي في السرطان. كما أن الزيغ الصبغي Chromosomal Aberrations المترافق مع الافتراق الصبغي خلال الانقسام يحدث بشكل أشيع في الخلايا ذات الصبغة المختلة صبغياً. كل هذه الملاحظات تشير إلى أهمية محتوى ال DNA ( الصبغة الصبغية) في آلية نشوء السرطان.
إن الدراسات السابقة حول قيمة كمية DNA الإنذارية في الآفات الفموية قبل السرطانية تضمنت أقل من 25 مريضاً مع متابعة استمرت خمس سنوات، لكن دراستنا الحالية حول أهمية محتوى الخلايا من DNA في الطلاوة الفموية عند 150 مريضاً تمت مراقبتهم لمدة 9 سنوات.
الطرق Methods
التأكد من عسر التصنع Ascertainment Of Dysplasia
أخذت خزعات استئصاله من 242 مريضاً مصاباً ببقع بيضاء فموية بين عامي 1982 و 1995 وذلك في ثلاث منشآت في النرويج Norway :
University Hospital in Bergen and the Department of Otolaryngoloy and the Department of Oral Sugeny and Medicine at the University of Oslo in Oslo.
ثمَّ أعيد تقييم كل المقاطع النسيجية من قبل أربعة مشرحين مرضيين حسب توجيهات منظمة الصحة العالمية. تم الإجماع على وجود عسر تصنع عند 196 حالة من أصل 242 مريضاً 81 % من أصل 196 مريضاً وجد 36 مريضاً يعانون من كارسينوما داخل البشرة أو كارسينوما غازية داخل الفم واستبعدوا من الدراسة وكانت كمية النسيج قابلة للدراسة عند 150 حالة فقط من أصل 160 حالة، لذا أجريت الدراسة على 150 مريضاً مصابين ببقعة بيضاء صنفت على أنها عسر تصنع.
تم تشفير ( إعطاء رموز) لكل المقاطع وإعطاؤها درجة التمايز والنمط النسيجي بشكل عشوائي، تم تسجيل المرضى ال 150 في السجل السرطاني في Norway وانخرطوا في برنامج المتابعة، لم يُحدد حد أعلى لمدة المتابعة، تمت المتابعة سنوياً وتضمنت معاينة مخاطية الفم والبلعوم وجس العقد الرقبية وتجرى الخزعة فقط في حالات:
ظهور بقعة بيضاء غير معروفة مسبقاً أو نكسها بعد الاستئصال أو زيادة حجم بقعة بيضاء موجودة سابقاً. لم يغب أي مريض خلال المتابعة أما المرضى السبعة المتوفون لسبب آخر فقد روقبوا حتى تاريخ وفاتهم وتم تسجيل المعلومات عنهم خلال هذه المدة .
أجريت خزعة استئصالية للبقع البيضاء الظاهرة عيانياً الوحيدة وذات القطر 3 سم أو أقل. أما في حالة الآفات المتعددة أو الأكبر من 3 سم قطراً أجري لها استئصال لاحق مع التأكيد على أنها عسر تصنع. تم توثيق مواقع الآفات والكارسينوما اللاحقة باستخدام الترميز المكاني وفق مصطلحات العلم المنسقة في الطب Systematized .
Nomenclature Of Medicine وعُدَّت السرطانات الناشئة في المكان نفسه أو في منطقة مجاورة للبقعة البيضاء السابقة فقط على أنها حالة من سير المرض.
تم إعطاء المرضى المثبت استعمالهم للتدخين أو الكحول معلومات شفوية وكتابية حول عوامل الخطر لنشوء سرطان الفم وتعاد هذه المعلومات في كل زيارة عند المتابعة.
يُسأل المرضى حول استعمالهم التدخين عند التشخيص المبدئي للطلاوة الفموية ( توجد قصة استخدام تبغ بأي شكل أو استخدم سابق أو استخدام حالي) عند التشخيص المبدئي.
تلوين النماذج النسيجية: Staining Of Tissue Samples
تُقطع النماذج النسيجية المحفوظة بالبارافين والمثبتة بالفورم ألدهيد الواقي 4% لزيادة حساسية التحليل النسيجي، يعين المشرح المرضي مكان عسر التصنع ويستأصل المنطقة المحيطة بالآفة،تُقطع مقاطع مزودجة 50 نانومتراً وتحلل أنزيمياً ( بالنمط بروتياز 24) للحصول على نوى معزولة وطبقة وحيدة تالية، تلون المقاطع المجاورة بالهيماتوكسيلين أيوزين وتحلل نسيجياً لتعيين المحتوى الحثلي لكل نمط نسيجي.
قياس المحتوى من DNA Measurement Of DNA Content
يلون محتوى النوى من DNA باستخدام ملون Feulgen وملون Periodic acis-Dchiff ويحلل ويدرس حسب نظام Fairfield Ploidy System، ثم تدرس الطبقة الوحيدة باستخدام مجهر Zeiss Axioplan II مجهّز بمرشحة خضراء 546 نانومتراً ومزود أيضاً بكاميرا رقمية. تقاس نوى 300 خلية على الأقل وتجمع المعلومات في حقل مُحسّب أو في إطار لكل مريض وتشترك اللموفاويات على أنها مراقبة داخلية ويقاس محتوى DNA في الخزعات عند التشخيص المبدئي لعسر التصنع وفي زيارات المتابعة. إن المعدَّل الوسطي لمعامل تغير محتوى DNA في النوى خلال ذروة الصيغة الصبغية كما هو مسجل بعدد النوى التي كان لكل صبغي فيها نسختان (2C) كان 5.7 % وتراوح بين 7.9 – 3.3 عند كل ال 150 مريضاً.
معيار تصنيف محتوى ال DNA Criteria For The Classification Of DNA Content
تم ترميز كل العينات وتصنيف ال DNA بطريقة عمياء من قبل أربعة مرشحين مرضيين. إذ أخذت عدة خزعات من المريض نفسه بوقت واحد تُحلل كل العينات المأخوذة ويبنى التصنيف على المحتوى الأكثر شذوذاً إذا كانت النتائج متباينة .
تصنف الآفة على أنها مزدوجة الصيغة Diploid إذا وجدت ذروة وحيدة (أي نسختان) خلال الطور Go و Go1 لا يتجاوز 10 % من المجموع، أو كان عدد النوى ذات المحتوى من ال DNA أكثر من 5C لا يتجاوز 1 % من المجموع الكلي. وصنفت الآفة على أنها رباعية الصيغة Tetraploid إذا وجدت ذروة 4C خلال الطور Go و G1 معاً مع ذروة 8C خلال الطور G2 أو كان عدد النوى ذات 4C ذروة الطور G2 تزيد عن 10 % من المجموع. وتصنف على أنها مختلة الصيغة الصبغية Aneuploid إذا وجدت ذُرا مختلفة الصيغة ( 3C أو 7C أو 9C )، أو إذا كان عدد النوى ذات المحتوى من ال DNA أكثر من 5C أو 9C يزيد عن 1 % من المجموع الكلي.
التحليل الإحصائي Statistical Analysis
إن معدلات البقيا المرتبطة بمحتوى ال DNA وبالتمايز النسيجي ينبت حسب طريقة Kaplan- Meier . إن نقطة النهاية هي نشوء كارسينوما شائكة في الفم. يُراقب المريض بطريقة Kaplan- Meier إذا توفي لسبب آخر.
استخدم اختبار Log –rank لتقييم القيمة الإنذارية لمحتوى ال DNA بالعلاقة مع المدة الحرة الخالية من المرض. قُيّم اختلاف النسب باستخدام اختبار Chi-Square واستخدم تحليل علاقة Bivariate لتقييم العلاقة بين شدة عسر التصنع وكمية محتوى ال DNA ، استخدمت طريقة CoX النسبية التراجعية لتحليل العوامل المتغيرة، وقد استبعد من هذه العوامل المتغيرة كل من حجم الآفة واستخدام الكحول أو عدم استخدامه. إن الخطر التراكمي لنشوء الكارسينوما تم جمعه بشكل نسب احتمالية تم تكييفها حسب العمر والجنس والتدخين.
النتائج: Results
صفات المرض: Characteristics Of The Patients
قُيمت جميع العينات من قبل أربعة مشرحين مرضيين وصنفت حسب المحتوى ال DNA .
والمعدل الوسطي للمتابعة به التشخيص البدئي لعسر التصنع هو 103 شهراً (165- 4 شهراً). تطورت عند 36 مريضاً : 3 مصابون بآفة مزدوجة الصيغة الصبغية و 21 مريضاً مصاباً بآفة مختلة الصيغة الصبغية و 21 مريضاً مصاباً بآفة رباعية الصيغة 24 % . وقد تطورت كارسينوما شائكة على البقعة البيضاء السابقة أو قربها بعد معدل وسطي 49 شهراً (78 – 4 شهراً). في كل المرضى ما عدا مريضاً واحداً فقط من ال 36 مريضاً (لديه آفات مزدوجة الصيغة الصبغية) تطورت الكارسينوما خلال خمس سنوات بعد التشخيص المبدئي لعسر التصنع.
في أربعة مرضى أجريت خزعتان لكل واحد منهما لأن آفتهما البدئية تزيد عن 3 سم قطراً ولم نتمكن من استئصال الآفة كلياً في مرحلة واحدة واحتاجت لإجراء آخر بسبب وجود عسر تصنع في الخزعة الأولى. وفي كل المرضى الأربعة صنفت الخزعات بأنها تملك المحتوى نفسه في الDNA : اثنان لديهما آفات مختلة صبغياً واثنان لديهما آفات مزدوجة الصيغة الصبغية: في المريضين المصابين بآفة مختلة صبغياً تطورت الكارسينوما بعد 38 و 50 شهراً من المتابعة ولم يحتج أي مريض لخزعة أخرى خلال مراجعاته. في 36 مريضاً تطورت لديه كاسينوما، أخذت خزعات لاحقة عند 28 مريضاً منهم (78 %) وأخذت هذه العينات من مناطق مختلفة غالبها على الحافة الوحشية للسان أو أرض الفم وكانت ثنائية الجانب في 16 مريضاً.
روقبت حالة 7 مرضى حتى وقت وفاتهم لسبب آخر وسُجلت عنهم المعلومات، خمسة مرضى لديهم آفة مزدوجة الصيغة واحد لديه آفة رباعية الصيغة، وواحد لديه آفة مختلة الصيغة، وذلك حسب تصنيف الخزعة البدئية، ولم يفقد أي مريض آخر خلال المتابعة.
ثنائية ال DNA Ploidy DNA :
من أصل المرضى ال 105 المصابين بآفة بدئية مزدوجة حافظ 103 منهم على الصيغة نفسها خلال فترة المتابعة ( وسطياً 74 شهراً وتراوحت بين 103 – 37 ) ، واثنان منهم تغير نمط الآفة لديهم إلى مختل الصيغة وفي هؤلاء 105 مرضى تطورت الكارسينوما عند ثلاثة منهم بعد 35 و 46 و 76 شهراً، وقد عُدّت الآفات أنها ذات صيغة مزدوجة إذا حافظت عليها في كل المتابعات، لم تغير الآفة عند 20 مريضاً مصنفاً كرباعي الصبغيات صيغتها خلال المتابعة وقد تطورت الكارسينوما عند 12 مريضاً منهم ( 16%) بعد 49 شهراً وسيطاً ( 78 -8)، من 27 مريضاً ذا صيغة مختلة هناك 25 مريضاً كانوا مختلي الصيغة عند بدء التشخيص واثنان استحالت آفاتهما من مزدوجة الصيغة إلى مختلة الصيغة خلال فترة المتابعة ولم تظهر الكارسينوما عند هذين المريضين. وعند 25 مريضاً ذا الآفة المختلة صبغياً منذ بدء التشخيص، تطورت كارسينوما عند 21 منهم (84%) بعد 35 شهراً (57-4 ) ، هناك فرق واضح بين المرضى ذوي الآفة رباعية الصيغة وذوي الآفة المختلة صبغياً بالنسبة للمدة بين بدء التشخيص ونشوء الكارسينوما. إن نسبة الفترة الحرة التراكمية الخالية من المرض كانت 97 % في مجموعة الآفة مزدوجة الصيغة و 40% في المجموعة رباعية الصيغة و 16% في الآفة المختلة صبغياً.
قورن الخطر التراكمي لنشوء كارسينوما في المجموعة رباعية الصيغة ومختلة الصيغة مع الآفة مزدوجة الصيغة وكانت 20.2 و 27.6 على الترتيب. أجري تحليل للصيغة الصبغية عند كل 150 مريضاً بعد تغير آفة اثنين منهم من مزدوجة إلى مختلة الصيغة ( بعد 43 و 62 شهراً) وكانت الفترة التراكيمة الحرة الخالية من المرضى 95 % في الآفات المزدوجة و 40 % في الآفات رباعية الصيغة و 18 % في الآفات المختلة صبغياً وكان الخطر النسبي المرتبط بنشوء كارسينوما فموية 20 في الآفات رباعية الصيغة و 27.2 في الآفات المختلة صبغياً. ويظهر أن القيمة التوقعية السلبية في الآفات ذات الصيغة المزدوجة البدئية في نشوء كارسينوما هي 97 % والقيمة الإنذارية الإيجابية في الآفات ذات الصيغة المختلة صبغياً هي 84 %.
الدرجات النسيجية Histologic Grades :
من أصل 150 مريضاً 49 منهم 33 % صنفت آفتهم نسيجياً على أنها ذات عسر تصنع خفيف و ( % 38) 57 ذات عسر تصنع متوسط و (%29) 44 ذا عسر تصنع شديد. وكانت الفترة التراكمية الحرة الخالية من المرض 68 %في المجموعة خفيفة الدرجة و78% في المجموعة المتوسطة الدرجة و 82% في المجموعة شديدة الدرجة ولا يوجد بالتالي هناك أي اتباط مقنع بين الدرجة النسيجية ومحتوى ال DNA .
عوامل الخطر في نشوء الكارسينوما الفموية Risk Factors For Oral Carcinoma
أخذت معلومات حول استخدام الدخان من السجلات الطبية عند 100 مريض كما أخذت عند 37 مريضاً عبر الهاتف وقد تم جمع المعلومات عند التدخين (لا توجد قصة استخدام تبغ بأي شكل أو استخدام سابق أو استخدام حالي). كان هناك من بين ال 137 مريضاً هناك 27 ( 21امرأة) لم يستخدموا التدخين مطلقاً وقد تطورت الكارسينوما عند 5 من أصل 27 مريضاً لم يسبق لهم أن دخنوا، وعند 22 مريضاً من أصل 85 مريضاً مدخناً بشكل مستمر ، وعند 13 مريضاً لم يعرف عنهم إذا دخنوا أم لا نشأت كارسينوما فموية عند اثنين منهم خلال المتابعة وتمت دراسة أهمية الصيغة الصبغية المختلة واستخدام الدخان وعدم الاهمام بصحة الأسنان (نخر مزمن غير معالج، التهاب حول الأسنان) فظهرت أنها عوامل إنذارية هامة في حين لم يكن للعمر والجنس دور مهم. كما أن كلاً من اختلال الصيغة واستخدام التبغ المديد ونقص الاهتمام بصحة الأسنان عوامل إنذارية هامة لكن يُعد كل من اختلال الصيغة والتدخين المديد عوامل إنذارية أدق.
المناقشة Discussion
نتائج هذا البحث العلمية، هي المراقبة بحذر للمرضى المصابين بطلاوة فموية مع صيغة صبغية مزدوجة من DNA وعلى العكس منها فإن الآفات ذات الصيغة المختلة يجب أن تعالج ككارسينوما حقيقية. كما وجد أن نسبة التحول الخبيث في الطلاوة الفموية عالية (%24) مستثنين من ذلك المجموعة ذات الخطر العالي. لم تشمل الدراسة: المرضى المصابين بطلاوة حمراء Erythroplakia سابقة أو مواقتة لأنها تحمل خطراً أعلى لنشوء سرطان الفم ( 90 %) كما استثنينا المرضى المصابين بورم مواقت أو سابق في السبيل الهضمي التنفسي العلوي بسبب إمكانية نشوء آفات متعددة كنتيجة لهجرة الخلايا الخبيثة عبر السبيل الهضمي التنفسي العلوي. كما استثنى من الدراسة المرضى الستة والثلاثون الذين ظهر لديهم نشوء سرطانة داخل البشرة أو غازية عند التشخيص البدئي بسبب استعدادهم لإظهار كارسينوما ثانية.
تضمنت الدراسة المرضى الذين تم استئصال البقعة البيضاء لديهم بشكل كلي وقت التشخيص أو خلال المتابعة، وتعد بعض هذه الخزعات على الأقل وسيلة علاجية لذا فمن المرضى ال 27 المصابين بآفة مختلفة صبغياً فإن الستة الذين لم تتطور لديهم كارسينوما خلال المتابعة يمكن أن يكونوا قد عولجوا بالخزعة الاستئصالية.
وقدرت أهمية القيمة الإنذارية الإيجابية ب 84 % في الآفة ذات الصيغة المختلة حول إمكانية الاستحالة لسرطانة غازية أو داخل البشرة.
في المرضى ال 20 المصابين بآفة رباعية الصيغة الصبغية لم تظهر أهميتها كقيمة إنذارية في السير السريري بقياس ال DNA لأن هذه الآفة قد تمثل محطة عبور من الصيغة الطبيعية إلى المختلة ثم تراقب هذه الأخيرة بمرحلة متأخرة وعندها يمكن أن تظهر الدراسة النسيجية أهمية القيمة الإنذارية لهذه المجموعة.
هذا وتدعم فكرة عديدة النسيلة Multiclonal (حقل التسرطن) بأن المرضى المصابين بسرطان في الفم يُظهرون عدة أورام بدئية أو ثانوية. على أية حال يمكن أن تنشأ آفات عسر التصنع متعددة المواقع من موقع بدئي وحيد بسبب الهجرة الوحشية داخل البشرة أو الانتشار داخل الفم أو بسبب تغيرات مورثية إضافية تكسبها نمواً إضافياً. إن المنشأ النسيلي للآفات قبل السرطانية أو السرطانية في المريض نفسه يُدعم بالموجودات الخلوية الحديثة. كما أن الفرضيات الأخرى للمنشأ عديدة النسيلة أو وحيد النسيلة للسرطانات المتعددة في الفم يتوافق مع موجودات بحثنا هذا في أن اختلال الصيغ الصبغية الموجودة في واحد فقط من عدة عينات مأخوذة بشكل متواقت أو متلاحق من المريض نفسه يمكن أن يستخدم كمنبىء عن نشوء سرطان لاحق.
في دراستنا يبدو أنه ليس لاستخدام الدخان دور معارض لملاحظة أن الصيغة الصبغية (DNA) هي واسم إنذاري هام عند المرضى المصابين بطلاوة فموية. من الصعب الحصول على معلومات صحيحة حول استهلاك الكحول لذا لا يمكن استبعاد دور استهلاك الكحول في نشوء السرطان نظراً لأن الكارسينوما تنشأ عند عدد قليل نسبياً من المرضى المصابين بطلاوة أو المدخنين أو الكحوليين أو أي منهم إلا أن العوامل الجينية تؤثر بصورة أقوة في الاستحالة الخبيثة للبقع البيضاء، ونتيجة لذلك فإن تمييز المرضى المحتاجين لنصيحة مانعة عن التدخين عن أولئك المحتاجين للتداخل العلاجي يشكل عائقاً لطبيب المعاين.
ورغم أن العلاج المكثف للطلاوة ذات الصيغة المختلة صبغياً يمكن أن يقلل احتمال الوفاة من الكارسينوما شائكة الخلايا بنسبة غير معروفة، فإن العلاج التقليدي والوقاية الكيماوية لم يحسنا بشكل ملحوظ نسبة البقيا لخمس سنوات عند المرضى المصابين بكارسينوما شاكة الخلايا ربما بسبب التداخل الذي يأتي متأخراً جداً.
إن زيادة وقوع سرطانات الرأس والعنق حتى عند الشباب يؤكد ضرورة الكشف الباكر للبقع البيضاء التي يمكن أن تتطور إلى كارسينوما.
